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        鑒別含量 ? 色譜分析

         

        ·檢測依據

          - 中國藥典2020年版四部通則(0512)高效液相色譜法

          - 中國藥典2020年版四部通則(0514)分子排阻色譜法

         

        ·原理

          - 蛋白質供試品通過高效液相色譜分析,結果利用峰面積歸一法計算得出主峰的純度百分比、分子量。

         

        ·檢測范圍

          - 蛋白質樣品,包括但不限于中間產物、原液、成品和穩定性樣品。

         

        ·主要設備

          - 高效液相色譜:Arc,Waters

         

        ·樣品要求

          - 總量:>300ug

          - 狀態:無色澄清液體/白色固體

          - 純度:>95%

         

        ·交付內容

          - HPLC純度(反相)

          - HPLC純度(分子篩)

          - SEC-MALS分子量

         

        SEC-MALS原理

        SEC:尺寸排阻色譜法;有時稱為GPC/GFC,即凝膠滲透色譜法或凝膠過濾色譜法。

         

        GPC/SEC是根據不同的分子具有不同的流體體積而進行分離,而不是根據分子的分子量大小。色譜柱中填充了表面具有很多小孔的填料顆粒。當樣品分子隨流動相一起流經填料時,尺寸較小的分子能從填料顆粒表面的孔進入其內部。而較大的顆粒只能從填料顆粒之間的間隙通過。經過一段時間,樣品中含有的不同尺寸的分子由于經過的路徑長短不同而實現分離。通過調整填料顆粒表面的孔徑大小,可以對一定分子尺寸范圍的樣品進行分離。

         

        首先通過高效液相色譜的SEC柱根據供試品不同組分的不同分子尺寸分離出不同的峰(圖1),再通過激光光散射檢測器利用色譜柱分離出的樣品在各個角度的光散射強度測量分子的尺寸大?。▓D2),通過示差折光檢測器測出供試品洗脫液的濃度(圖3),從而計算出各個組分的絕對分子質量和占比。

        △圖1. 尺寸排阻色譜原理示意圖

         

        △圖2. 多角度激光光散射檢測原理示意圖

         

        散射光與分子量,濃度以及折射率增量的平方成正比,可用以下公式表示:

         

        △圖3. 示差折光檢測原理示意圖

         

         

        平臺檢測方法

        柱子:TSK G3000SWXL 7.8mm × 30cm 5µm

        分子量范圍:10kd-500kd

        流動相:25mM PB 150mM NaCl溶液

        備注:若客戶可提供柱子和方法,要走特殊方法的可咨詢后開展檢測。

         

        案例分析

        △供試品的LS 聚體信號圖譜

         

        △供試品的UV 聚體信號圖譜

         

        △供試品的分子量計算結果

        注:Mn為數均分子量,Mp為峰位分子量,Mw為重均分子量,Mz為Z均分子量。

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