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      1. 常見問題

        常見問題
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        MALDI分子量分析樣品是如何樣品制備? 2023-05-17 樣品若是溶液樣品,濃度及鹽離子濃度合適,直接進行上機測試,不經處理。若是固體樣品,直接溶解在20%ACN,0.1%FA,等易揮發試劑中,進行上機即可。
        樣品中含糖時能否進行分子量測試? 2023-05-17 樣品中是多糖位點,多種糖型時, 因為出峰較雜,規律性較差,無法進行去卷積。在MALDI-TOF的分子量測試時 ,因為含糖基之后的蛋白質在飛行管內的飛行路線會發生改變。所以導致檢測分子量不準確,一般會偏小1-2萬分子量。
        高分辨分子量與MALDI-TOF分子量兩種方法的差異? 2023-05-17 高分辨分子量通過液質聯用的方法,通過C4色譜柱的保留分離,(前10Min有 Load過程,相當于脫鹽),帶電范圍M/Z 400-4000,可帶多電荷。誤差較小。MALDI-TOF通過帶一個電荷,離子化方式通過激光激發檢測。兩者在3000Da以下的分子量檢測精度和誤差上沒有區別,可選擇MALDI-TOF測試。對大分子,3000Da以上的可以選擇高分辨,誤差較小。高分辨分子量對樣品要求較高,需要純度較高,糖基化等修飾少。
        同一樣品N端測試與電轉印之后的N端測試結果有何差異? 2023-05-17 樣品純度未達到標準,導致直接測試時出峰較雜,無法判斷。電轉印+N端相當于純化的過程,將目標部分進行測試,經過純化的樣品雜峰較少,故可以判斷各個循環。
        N端測試各個循環均無峰的原因分析? 2023-05-17 樣品N末端存在封閉或者發生修飾,無法進行正常反應,所以后續循環均不出峰?;蛘邩悠分械鞍踪|含量太低,無法進行測定。
        N端測序含有非標準氨基酸的序列在圖譜上怎么反映? 2023-05-17 由于標準品是由19種天然氨基酸組成,每個循環裂解下來的氨基酸都跟標準進行比對,從而實現定性。如果樣品中含有非標準氨基酸,裂解下來的峰將會和所有19種氨基酸都對不上,從而無法判斷。
        N端測序樣品中為什么不能含有甘氨酸或其他游離氨基酸?應該怎么處理? 2023-05-17 蛋白質樣品有時候為了穩定而添加了保護劑,如果樣品中添加了游離氨基酸,在測序時會造成污染??梢詫悠愤M行透析等處理,去除干擾物。
        N端測序含有多個亞基的蛋白質怎么測序? 2023-05-17 含有多個亞基的蛋白質由于不止一個N端,在測序時會與多個含有游離a氨基結合并裂解下來,導致每個循環的圖譜上出現多個峰,影響序列的判斷。所以,對于含有多個亞基的蛋白質,我們通常通過還原性電泳,將不同的亞基分開,再通過電轉印將不同的亞基轉到PVDF膜上,分別進行N端測序。也可以將樣品用還原劑還原后,通過HPLC分離各亞基,收集各亞基分別進行N端測序。
        不知道理論二硫鍵配對方式,是否可以從實驗中判斷理論配對方式? 2023-05-17 沒有理論配對方式,試驗結果無法進行判斷是否和理論一致。
        HPLC肽圖檢查法的實驗重復性如何?能否做到樣品和對照的比較? 2023-05-17 重復性較好,能通過和標準對照品一同實驗來比較一致性,主要是判斷出峰數量和出峰時間的一致性。最好是樣品和對照品一同酶解,一同進行液相檢測。如果中間隔較長時間,且不是同一批酶解,可能會出現細小的差別。主要是酶解較難控制。
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